一文读懂 ChIPseq

一、介绍

• ChIP-seq，测序方法
  • ChIP 指染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP），
  • seq 指的是二代测序方法
• 作用：识别蛋白质与DNA互相作用情况
• 原理：染色质免疫共沉淀 + 二代测序
• 应用：常用于转录因子结合位点和组蛋白修饰位点的研究

二、测序原理

1、使用甲醛将目标蛋白（组蛋白，转录因子等）与染色质交联固定起来

2、从细胞裂解液分离基因组DNA，通过超声打断DNA为一定长度的小片段

3、添加与目标蛋白质特异的抗体，该抗体会与目标蛋白形成免疫结合复合体沉淀，收集这些沉淀

免疫结合复合体 = 靶蛋白 + 抗体 + 靶蛋白结合的DNA

4、去交联，分开蛋白与DNA，纯化DNA即可得到染色质免疫沉淀的DNA样本

5、建立好文库，用测序仪进行测序

详细测序过程可以参考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/58708887

三、检测蛋白质与DNA序列的结合峰

1、测序片段匹配到参考基因组

将测序得到的 DNA 片段（sequenced fragments）匹配到参考基因组。

很显然，如果在基因组的某个位置蛋白质结合的概率越大，那么在该位置检测到 DNA 片段堆叠就会越高。反之，如果没有蛋白结合，在该位置就会几乎没有DNA 片段堆叠。为了研究方便，我们将这些DNA片段堆叠叫做峰 (Peak)。

2、检测峰

将覆盖到参考基因组的DNA片段堆叠用柱状图画出来，就会看到峰。

这里需要知道，ChIPseq是利用抗体去结合特异的靶蛋白，进而去沉淀靶蛋白结合的DNA。理论上，只要抗体设计的好，与蛋白质结合的 DNA 的都可以检测到。

我们一般用 ChIPseq 检测转录因子的结合，以及检测组蛋白修饰，二者有着截然不同的峰形：

转录因子结合的特征峰，峰型高，而且窄：

组蛋白修饰结合的特征峰，峰型起伏，而且分布广泛：

当然我们也可以使用，UCSC基因组浏览器显示。

3、提高峰质量

一般在做ChIPseq时，会加入一组空白对照（control），提高峰质量，那么为什么？

• 一般检测出的峰值会有背景噪音，也就是文库会夹渣一些没有用抗体捕获的DNA片段也被测序了。
• 开放的染色质区域比封闭的区域更容易断裂
• 序列在基因组中分布不均
• 允许我们在比对的控件中与相同区域进行比较
• 消除 ENCODE 的 Black list的影响

所以会准备空白对照，排除假阳性，对照组有有两种类型：

• input DNA：不用任何抗体捕获的DNA；
• mock IP DNA：用不含有抗体的DNA

这样一来，就会让我们检测到的峰更明显更接近真实的生物学特征。

四、影响ChIPseq测序结果的因素

1、免疫共沉淀的影响

• 高效特异性抗体
• 起始样本量
• ChIP DNA 产量
  • 细胞类型
  • 标记或蛋白质丰富程度（组蛋白比TF具有更高的结合覆盖率）
  • 抗体质量

对于组蛋白，使用来自T细胞的20ug染色质DNA作为起始材料，总共会得到15-50ng DNA。

对于TF，通常从2500万个细胞（200ug染色质）中得到5-25ng。

-Subhash Tripathi，ResearchGate

• 染色质片段
  • 片段大小：影响ChIP-seq中的信噪比
  • 因细胞类型而异
  • 偏向启动子区域的片段会在ChIP 和对照样品中的启动子上引起ChIP-seq富集

2、测序的影响

• Reads 长度
  • 较长的 Reads 和双末端 Reads 可提高匹配率
  • 对于等位基因特异性染色质事件，转座因子研究是必需的
• 避免分批次
• 序列输入对照的深度等于或大于IP样本
• 测序深度
  • 对于转录因子：最小5-10M
  • 对于组蛋白修饰宽谱图则更高：标准为20-40M

测序深度的对组蛋白修饰检测的影响

下面是在不同测序深度下检测人的 H3K4me3 组蛋白修饰ChIP图谱。

绿色框对应于基于SPP宽峰检测方法得到的显著富集区域。

在 5M (500 Reads) 中，未检测到突出显示的富集区域。

同样，我们换成 H3K27me3 组蛋白修饰。

这时在3.5M和10M 的低深度处未检测到突出显示的HOXD11和HOXD-AS1基因座处的富集区域（蓝色框）。

从每个子样本中H3K4me3，H3K36me3和H3K27me3回收的全部数据中获得的显著富集区域的百分比

总的来说，随着测序深度增加，组蛋白修饰检测比例开始会快速增加，随后达到平稳。测序深度饱和点取决于组蛋白修饰和所研究的物种基因组。

3、重复样和重现性

• 重复多次通常比更高的深度更有效
• 最好是低深度测序高质量样本，而不是高深度低质量样本

参考：

https://academic.oup.com/nar/article/42/9/e74/1248114

https://en.wikipedia.org/wiki/ChIP_sequencing#/media/File:Chromatin_immunoprecipitation_sequencing.svg

https://www.abcam.com/epigenetics/studying-epigenetics-using-chip