在全国的这场战疫中，我们每个人都密切关注着每时每刻的疫情动态，尤其是物质供应和新型冠状病毒的确诊情况。其中，作为检测新冠病毒的主力，核酸检测试剂盒常常出现在大家的视野中，那么它是怎么检测疑似患者携带有新型冠状病毒？

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知己知彼

在识别新型冠状病毒之前我们先了解一下它：

这种病毒是一类具有包膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，颗粒呈圆形或椭圆形，直径约60-140nm。

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需要注意的是，上面的病毒照片是使用电镜放大到纳米级拍摄的，也就是说通过一般的检测手段，几乎察觉不到它的存在。这种病毒感染人体后，其症状会从普通感冒到重症肺部感染，而且潜伏期长，会使病毒携带者在不经意间感染更多的人。因此，尽早检测出它的存在，来减少病毒携带者感染他人风险，使新冠状病毒患者得到及时的专业治疗就成为重中之重。

根据国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊 疗方案（试行第四版）》确诊病例需要有以下的病原学证据：

1.呼吸道标本或血液标本等 实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；

2.呼吸道标本或血液标本等病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。

目前，大部分的核酸试剂盒使用第一种方法，实时荧光 RT-PCR 来鉴定新型冠状病毒，这种技术的大概流程：

  • 获取疑似患者的样本，提取样本的核酸序列。
  • 将这些核酸序列（其中有可能包含有病毒核酸序列）与反应原料混合
  • 在反应容器中进行扩增反应（这种反应可以只扩大病毒核酸序列的数量），便于后续检测
  • 扩增后的核酸序列是带有荧光的，如果检测到荧光信号曲线符合病毒特征，那么就认为该疑似患者为阳性。
  • 在实际过程中，对一位患者会进行多次检测

需要的材料：核酸试剂盒，QPCR仪，电脑，样本等

下面，我们详细了解这种技术是怎么揪出新型冠状病毒的。

如何放大病毒信号

我们都知道作为核酸序列的DNA可以复制自身，这个过程如下：

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  • DNA先打开双链，暴露出模板
  • 引物（左右两个DNA片段）会特异性的结合到模板上
  • DNA聚合酶（黄色的几何体）就可以利用碱基（彩色的小圆点）从引物开始复制，这个过程也叫扩增
  • 只要这个反应有足够原料，新合成的DNA链又会作为模板链开始新的合成
  • 最终，开始的序列会被以呈指数级的增加。利用这个特性，可以放大样品中微弱的病毒序列信号

实际上，早在上个世纪，一位叫穆利斯（Kary Banks Mullis）的牛人在体外实现了DNA复制过程。该技术被命名为聚合酶链式反应（PCR），因这个伟大的发明他在1993年获得了诺贝尔化学奖。

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但是，需要注意的是2019新型冠状病毒是一种RNA病毒，PCR是针对DNA复制来设计的。

因此，我们需要将RNA逆转录为cDNA，然后进行DNA复制的过程，这个技术也叫RT-PCR（逆转录-PCR）。

如何只放大新型冠状病毒的信号

接下来的问题是怎么去识别2019新型冠状病毒，避免检测到其他的序列信号？

大家会注意到在PCR过程中，只有引物会特异性的结合到模板上，也就是说，设计好的引物可以识别新冠病毒的核酸序列。引物的设计工作就成为病毒检测成功与否的关键。

科学家根据已发布的2019-nCoV全基因组序列，通过序列比对寻找具有 2019新冠状病毒高度特异性的核酸序列，该序列可以特异鉴别2019新冠状病毒。

根据这个特点，在此区域设计特异引物用于2019新型冠状病毒鉴定。

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如何进行信号检测

为了能够实时检测到核酸序列的变化情况，在PCR的反应体系中往往需要加入探针或染料用于荧光信号捕获。同时需要QPCR仪，这种仪器可以将荧光信号采集为计算机可以识别的数字信号，用于后续诊断依据。这里涉及的两种产生荧光的物质有着不同的发光原理：

  • 荧光染料：一般这种游离的染料几乎没有荧光信号，一旦结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。
  • 荧光探针：依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的核酸片段两端分别带有荧光基团和淬灭基团。
    • 一般情况下，两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。
    • PCR扩增时，探针的结合位置位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时，一种切割酶会将荧光基团切下来，从而使其发出荧光。
    • 检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。

为了提高每次检测的人次，检测人员会将样本放置在孔板上，每个孔即为一个样本。同时，会加入空白对照，阳性对照，阴性对照来提高准确率。

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接下来，使用计算机软件分析，会有几种结果：

  • 空白对照，不会扩增

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  • 内参样本：会加入人源性内参基因的检测，满足临床对样本质量控制的需要，降低假阴性率。如果，该样本没有扩增曲线，需要检查质控情况

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  • 阴性对照：这里阴性对照，不会扩增

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  • 阳性对照：同样，阳性对照样本是存在已知新冠病毒的核酸（也就是说，已知该样本肯定要扩增），为了降低假阳性率。

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病原检测人员会根据以上的数据来判断该患者是否为新冠病毒阳性。

最后，看看检测人员平时的工作状态：

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新冠病毒对我们来说只是个新闻字眼，但是对于他们来说只隔着一层防护服。而且几乎所有奋战在一线的科学家，医护工作者，志愿者们都是身披这身战甲，在前线日夜奋战。他们无数人洒下泪水与汗水，更有人奉献出自己的生命，但是更多的人不是悲伤和恐惧，而是继续奔赴前线。也许艾青在《我爱这土地》中，早已给出他们奋不顾身的原因：

假如我是一只鸟，
我也应该用嘶哑的喉咙歌唱：
这被暴风雨所打击着的土地，
这永远汹涌着我们的悲愤的河流，
这无止息地吹刮着的激怒的风，
和那来自林间的无比温柔的黎明……
——然后我死了，
连羽毛也腐烂在土地里面。
为什么我的眼里常含泪水？
因为我对这土地爱得深沉……